RESUMO

O presente estudo teve por objetivo avaliar quantitativa e qualitativamente as reações que o organismo desenvolve em relação a duas drogas utilizadas como medicação intracanal – iodofórmio e hidróxido de cálcio -, quando as mesmas são implantadas em dorso de ratos. Para tanto foram utilizados vinte ratos albinos (Rattus norvegicus, var albino, linhagem Wistar), nos quais foram realizadas duas incisões no seu dorso onde foram inseridas, para um mesmo animal, a medicação a ser testada em seu veículo e consistência de uso clínico. Os grupos experimentais eram representados pelo grupo do tecido normal, íntegro (GCI), a ferida controle (GCII) onde nenhuma medicação foi colocada e os grupos tratados com iodofórmio (FOD) e hidróxido de cálcio (FOE). Passados períodos de três, cinco e onze dias, a região onde foi implantada a medicação era removida em bloco com o tecido adjacente. Neste momento a condição macroscópica era observada. Os fragmentos eram levados para fixação em Bouin e processados para análise histológica com a coloração H-E e tricrômico de Mason. Os mesmos eram submetidos a análise qualitativa e quantitativa. Neste caso através da avaliação de fotomicrografias com 550X de aumento de campos representativos do subcutâneo que deveriam ser divididas em 100 pontos com uma grade onde as estruturas mais representativas deveriam ser contadas seguindo a seguinte denominação: células epiteliais, fibras colágenas, fibroblastos, macrófagos, linfócitos, neutrófilos, vasos e outras estruturas (áreas de necrose, fibrócitos, folículos pilosos, espaços,...). Pode ser observado que o FOD interferiu menos no processo de reparo enquanto o FOE mostrou grande área de necrose que demorou todo o período experimental para ser parcialmente recomposta. Já a  análise quantitativa mostra para o FOD uma demora na inicialização da resposta, com um pico da reação inflamatória aos 5 dias; enquanto para o FOE uma grande área de necrose foi observada, demonstrando uma condição mais favorável após onze dias de estudo.

Palavras-Chave: Iodofórmio – Hidróxido de Cálcio – Reparo de Lesões – Endodontia – Reação Inflamatória - Periapical

 

1 INTRODUÇÃO

Dentre as inúmeras indicações do tratamento endodôntico, as principais respondem pela presença de um quadro inflamatório pulpar, ou uma contaminação do sistema de canais radiculares. Uma vez povoado por microorganismos, seus subprodutos tornam-se fontes constantes de agressão que demandará, por parte do hospedeiro uma alteração no tecido da região periapical que se traduz pela formação de lesões.

Este processo, desenvolvido como resposta, é composto por uma série de reações inflamatórias e passa por duas fases propriamente ditas: aguda e crônica, uma destrutiva e a outra proliferativa respectivamente, sendo ambas caracterizadas por células específicas. Na região apical, as lesões agudas são identificadas como pericementites e abscessos agudos; granulomas, cistos e abscessos crônicos, no caso das crônicas. A contaminação pode se localizar na porção apical sob a forma de biofilme, que compreende um grupo de diferentes microorganismos unidos por um polissacarídio que se aderem às reentrâncias do cemento apical podendo, em função das condições ali presentes, estabelecer um ecossistema.

Desta forma, para que se possa restabelecer o equilíbrio perdido, torna-se imprescindível a remoção destes microorganismos e seus subprodutos, permitindo assim que o processo inflamatório possa progredir até o reparo. A sua vez, devem ser criadas condições desfavoráveis a um novo povoamento bacteriano, observando diferentes fatores no que se refere a estas colônias ali presentes. Desta forma, a utilização de uma droga que auxilie nestes quesitos torna-se imprescindível para o sucesso do tratamento, agindo em complementação ao preparo químico-cirúrgico, onde podemos salientar o hidróxido de cálcio e o iodofórmio.

Comparando a atividade destas duas drogas, eles possuem uma ação clínica semelhante, comprovada em laboratório no tratamento de lesões induzidas em cães e ratos (DANIEL, 2001, GOMES, 2003), com um alto índice de sucesso. Em relação á ação antibacteriana já pôde ser verificada uma ação semelhante para estas duas drogas, exceção feita á condição de anaerobiose, onde o iodofórmio foi mais eficiente necessitando, contudo de um contato para que as mesmas tenham ação efetiva (PALLOTTA, 2001; BREDER, 2003). Devido à necessidade de contato, torna-se importante avaliar a citotoxicidade celular destes, a qual demonstra ser maior para o iodofórmio quando aplicado sobre cultura de fibroblastos 3T3 (DANIEL; JAEGER; MACHADO, 1999). Clinicamente, outrossim, esta condição parece distinta, haja vista que o hidróxido de cálcio, quando extravasado e colocado em contato direto com a contaminação do biofilme, denota um índice de pós-operatório mais acentuado (DE MOOR; DE WITTE, 2002), o que não é observado quando da utilização do iodofórmio (PALLOTTA, 2002)

Para que este fato possa ser melhor esclarecido devem ser levada em conta as interações teciduais e assim buscar uma resposta apropriada. Desta forma a utilização da implantação destas medicações em dorso de ratos - cujo tecido conjuntivo guarda bastante semelhança com o humano – pode tornar possível um maior esclarecimento acerca do comportamento destes medicamentos, na busca por respostas acerca da qualidade clínica da resposta inflamatória.

2 REVISÃO DA LITERATURA 

2.1. Contaminação do Sistema de Canais Radiculares

Um grande número de microorganismos já foi identificado em condutos radiculares e em lesões periapicais. As bactérias isoladas variam muito com relação às suas exigências metabólicas - fermentação de determinados açúcares em maior ou menor quantidade - e também no que se refere à necessidade ou não de oxigênio - aeróbios, anaeróbios estritos ou facultativos, e microaerófilos. Torna-se, desta maneira, indispensável o conhecimento do papel desta contaminação e suas características.

2.1.1.     Papel das Bactérias no desenvolvimento de Lesões Periapicais

Para avaliar se microorganismos conhecidos (Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Pseudomonas aeruginosa e Bacteroides fragilis) em culturas puras inoculadas em canais radiculares poderiam causar inflamação periapical, Allard et al. (1979) utilizaram 14 cachorros que eram pulpectomizados e, em seguida, uma das espécies bacterianas era inoculada. Os dentes permaneciam selados, em tomavam-se amostras bacteriológicas em períodos constantes de 4 a 120 dias. Cepas vivas foram encontradas durante todo o procedimento. Radiograficamente puderam ser observadas áreas de radioluscência na maioria das raízes e, quando isso não ocorria, a cultura revelava-se negativa.

Fabricius et al., em 1982, propuseram-se a estudar a distribuição das diferentes espécies bacterianas em amostras de canais radiculares infectados após exposição intencional da polpa, comparando a presença dos diferentes tipos de microorganismos nos diferentes períodos de observação, bem como avaliar a quantidade de duas espécies microbianas no canal principal com aquelas na porção apical do sistema de canais. Foram então abertos 8 dentes anteriores de 3 macacas. Após 1060 dias de avaliação, pode ser constatada a predominância de bactérias anaeróbias estritas (de 85 a 98% das cepas) para todos os grupos, sendo tanto maior quanto mais antiga a lesão.

Em 1992, Sundquist realizou um estudo que elucidou alguns mecanismos de manutenção da flora endodôntica e suas inter-relações. O autor postula que uma série de fatores restringe a flora bacteriana do canal radicular a um grupo seleto de microorganismos; as alterações da população ocorrem com o passar do tempo e, em decorrência das condições propiciadas pelo meio, ocorre o aumento de anaeróbios estritos e a diminuição de aeróbios. A necessidade nutricional das bactérias é também um fator determinante na determinação do estabelecimento da infecção. E, com base nessas constatações, o autor afirma que a ação do tratamento endodôntico pode se dar tanto pela eliminação das bactérias quanto provocando o desequilíbrio da cadeia que existe entre as espécies predominantes e seus nutrientes.

Em uma revisão de literatura publicada em 1994, Sundquist apresenta a taxonomia, a ecologia e a patogenicidade da flora dos canais radiculares. O autor relata que as condições apresentadas pelos condutos são favoráveis ao crescimento de bactérias anaeróbias - capazes de fermentar aminoácidos e peptídeos, que são predominantes em um ambiente de necrose - em detrimento das bactérias restantes - que normalmente obtêm energia de carboidratos -, restringindo a flora não só pela condição da presença de oxigênio, mas também pelo tipo de nutriente. Durante o desenrolar da infecção ocorre uma interação ligada principalmente às necessidades nutricionais, que determinam o tipo de bactéria que ali persistirá.

O papel dos microorganismos no estabelecimento e no desenvolvimento das infecções endodônticas foi avaliado por Seltzer e Farber (1994). Os autores compararam as alterações da microbiota da cárie - desde o esmalte até a polpa -, bem como os fatores que levam ao comprometimento da região periapical, e constataram que os principais microorganismos presentes são os bacilos gram-negativos anaeróbios, sendo também encontradas espiroquetas.

2.1.2.     Infecção da região periapical 

Em estudo da flora endodôntica e periapical de dentes humanos com a utilização de microscopia óptica e de fase, Ramachandran Nair (1987) selecionaram 31 lesões - 30 granulomas e 1 cisto -, e constataram a presença de bactéria em todos os condutos. A flora do endodonto separava-se da lesão por uma intensa rede de polimorfonucleares, ou por um plug de epitélio no forame. Cinco dos dentes estudados demonstraram a presença de bactéria dentro e fora do conduto.

Tronstad et al. (1987) examinaram 8 pacientes com lesões periapicais inflamatórias assintomáticas - refratárias ao tratamento endodôntico em decorrência da presença de infecções endodônticas extrarradiculares. Os autores realizavam a cirurgia periapical, colhiam amostras do exsudato, do bloco da lesão e do ápice. Nos casos em que foi possível realizar o retratamento, também material do interior do conduto era colhido. No que se refere ao tipo de microorganismo encontrado, os autores observaram duas lesões exclusivamente contaminadas por anaeróbios, cinco com predominância desses microorganismos, e uma onde os estreptococos representaram 60% das bactérias presentes. Com relação ao número de espécies, observou-se um caso de monocultura e os outros 7 que manifestaram 3 a 6 espécies diferentes. O estudo demonstrou claramente que bactérias anaeróbias são capazes de sobreviver e manter uma doença infecciosa nos tecidos periapicais.

Utilizando microscopia eletrônica e óptica, Ramachandran Nair et al. (1990) investigaram a presença de bactérias na porção apical de canais radiculares e no periápice de dentes que, após terem sido tratados endodonticamente, evidenciaram lesões periapicais após um período de 4 a 10 anos. Foram realizadas 9 biópsias de lesões com esse perfil onde seis revelaram a presença de microorganismos. Quando não havia a presença de bactérias, as biópsias revelaram que as lesões eram reações de granuloma com células gigantes de corpo estranho.

Em estudo realizado através de microscopia eletrônica de varredura, procurou-se avaliar a presença de microorganismos na superfície de raízes de dentes com lesões periapicais refratárias ao tratamento endodôntico que foram submetidos a apicetomias. Microorganismos puderam ser observados em todos os espécies que aparentemente se apresentavam sem cobertura de cemento. As bactérias organizavam-se em colônias, recobertas por material amorfo. Na superfície das raízes era possível visualizar um tecido fino recobrindo a região; essa superfície, nos diversos casos encontrava-se em estágio de degradação. Também foi possível observar as bactérias unidas por um material extracelular - que caracterizou a presença do biofilme nas reentrâncias da superfície radicular (TRONSTAD; BARNETT; CERVONE 1990).

Em outro estudo, Tronstad, Kreshtool e Barnett (1990) descreveram o monitoramento microbiológico de um granuloma infectado que foi submetido ao tratamento endodôntico convencional, à antibioticoterapia sistêmica e ao tratamento cirúrgico. O tratamento endodôntico convencional não obteve sucesso, enquanto a terapia antibiótica via sistêmica apenas alterava a flora, sem contudo pôr fim à infecção, que só pôde ser debelada através de apicetomia – tratamento cirúrgico -, seguida de subseqüente neoformação óssea após 6 meses.

Para destacar o papel da infecção periapical no fracasso da terapia endodôntica, Siqueira (1997) consultou a literatura existente sobre o assunto observando que, se no início admitia-se a existência de lesões isentas de microorganismos, estudos mais recentes lançaram essa teoria por terra. Conclui o autor que o tipo e a quantidade de contaminação são mais importantes para o sucesso da terapia que o tipo de patologia desenvolvida.

Em 1998, Siqueira e Lopes realizaram um trabalho cujo objetivo era definir e explicar a estrutura do biofilme perirradicular, descrevendo sua estrutura, sua implicação no insucesso da terapia endodôntico, e as estratégias de tratamento. Sua estrutura básica advém de bactérias que estão aderidas à superfície apical e que são revestidas por uma matriz de lipopolissacarídios. A aproximação e a adesão microbiana a um substrato orgânico ou inorgânico leva as bactérias a se proliferarem; assim o biofilme atinge a maturidade, e as colônias organizam-se de acordo com as condições ambientais. A presença desse biofilme parece ser responsável por 15 a 100% dos casos de insucessos endodônticos.

A presença do biofilme periapical também foi avaliada, por meio de microscopia eletrônica de varredura, de pontas de raízes e de cones de guta-percha removidas durante procedimentos cirúrgicos ou tratamentos endodônticos de dentes portadores de lesões periapicais crônicas. Em nove dos 11 casos tratados foi encontrado o biofilme sobre a superfície estudada relatando a periodontite apical refratária (NOIRI et al., em 2002).

Buscando verificar a presença de biofilme periapical em dentes com necessidade de tratamento endodôntico, Leonardo et al (2002) avaliaram, através da microscopia eletrônica de varredura, a região apical de dentes que possuíam polpa vital e necrosada, neste caso com e sem a presença de lesão periapical. Os autores puderam observar o biofilme como uma constante somente em casos de dentes com lesão.

2.2. A Resposta do Hospedeiro – Inflamação Aguda ou Inespecífica, e Crônica ou Específica

Um resumo dos mecanismos imunológicos de defesa da polpa, mostrando o como os agentes antigênicos envolvem a resposta pulpar - as células e os componentes químicos envolvidos - foi realizado por Jontell et al, em 1998. Estes autores discutem, em especial, o papel das células dendriticas pulpares que, apesar de não serem capazes de identificar estes agentes, são fundamentais na ativação dos linfócitos T que levarão ao desenvolvimento e interação de outras células do sistema.

Oliveira, em 1999, descrevem as fases do reparo e suas características. A primeira fase, denominada de reação inflamatória, é caracterizada por breve vasoconstricção, seguida de vasodilatação e diminuição do fluxo sanguíneo, marginação leucocitária e diapedese, migrando os leucócitos – neutrófilos e posteriormente linfócitos - para a região da lesão. A segunda fase denominada reepitelização é caracterizada por hiperplasia e hipertrofia das células deste tecido e migração sobre o conjuntivo subjacente também destas células, folículos pilosos e outros anexos. A fase posterior, angiogênese, caracteriza-se por neoformação vascular, necessária para a oxigenação e nutrição da ferida, bem como drenagem dos catabólitos ali presentes, determinando a formação de miofibroblastos, característicos de um tecido de granulação. A fase de proliferação fibroblástica, o tecido de granulação tem como principais componentes celulares os fibroblastos.que produzem matriz celular, colágeno e glicosaminas que atuam na remodelação de tecido normal  e no processo de reparação. Por fim a contração da ferida, que é a quinta e última fase do reparo, caracteriza-se por uma diminuição dos vasos neoformados e de elementos celulares, com substituição do colágeno tipo III por tipo I, com contração progressiva da ferida.

O papel do sistema imunológico no desenvolvimento da periodontite apical, a partir do estabelecimento do processo infeccioso e a conseqüente determinação da lesão periapical devido à contaminação dos canais radiculares, foi discutido por Marton e Kiss, em 2000. Como resposta o organismo promove uma reação inflamatória que pode ser aguda ou crônica em função das condições e propriedades do microorganismo e do hospedeiro. Na lesão crônica são identificadas as células – linfócitos polimorfonucleares, linfócitos T – CD4 e CD8 -, B e NK, plasmócitos e macrófagos, além dos componentes químicos (citocinas que agem nas interações entre as células do sistema de defesa). Ainda são apresentados os efeitos locais e remotos dos agentes e mediadores da inflamação, demonstrando que suas interações são a chave para o entendimento do processo e sua quebra ou alteração será fundamental para encerrar este.

2.3. Medicações Intracanais

Abbott (1990) demonstra a importância dos medicamentos no sucesso da Endodontia, afirmando que é imprescindível a utilização de uma medicação complementar ao preparo para obter a limpeza adequada do sistema de canais radiculares. São propriedades fundamentais da droga a ser escolhida a ação bactericida, antiinflamatória bem como estimular a formação de tecidos duros sem ser tóxico ao hospedeiro. A escolha do material deve levar em conta as condições patológicas do dente a ser tratado

Para avaliar o papel da medicação intracanal na terapia endodôntica, Chong e Pittford realizaram um estudo, publicado em 1992. Inicialmente, os autores constatam que o tipo de resposta inflamatória depende diretamente da quantidade, do tipo e do tempo de exposição dos tecidos aos microorganismos e postulam que, na ausência de agentes contaminantes, os tecidos periapicais podem ser reparados. Deste modo, a realização de um tratamento de dentes vitais não implica o emprego de medicações intracanais. Já em dentes infectados, a utilização de medicações tem por objetivos: 1) eliminar as bactérias que porventura possam ali permanecer após a instrumentação; 2) reduzir a inflamação dos tecidos periapicais e remanescentes pulpares; 3) neutralizar os restos orgânicos que possam estar ali presentes; 4) agir como barreira à permeabilidade apical; 5) auxiliar a secar canais persistentemente úmidos. Para esses autores, a prescrição de medicações deve ser feita em casos de contaminação intensa e/ou em casos cujo intervalo de tempo entre as sessões seja grande.

2.3.1. Iodofórmio 

O iodofórmio, segundo a FDA (Food and Drug Administration), afirma que o iodofórmio pode ser utilizado para uso tópico e intra-dental. Apesar de ser positivo para testes de mutagenicidade in vitro, estudos conduzidos pelo programa nacional de toxicologia dos EUA (NTP-FDA) demonstraram, após acompanhamento de dois anos que o mesmo não é carcinogênico em ratos e camundongos. Nas doses apresentadas na literatura, o iodofórmio apresenta-se como não-tóxico e reações adversas ao seu uso não são constantemente relatadas.

Juge, em 1959, avalia a utilização de pastas reabsorvíveis para a obturação de canais, afirmando que as mesmas não deveriam interferir no processo natural de cura. Sua indicação deveria estar restrita aos casos em que os condutos apresentavam-se infectados, com ou sem lesão periapical, em que havia o risco de extravasamento de material obturador pelo periápice, nesse sentido, o autor concordou apenas com a indicação das pastas iodoformadas e de hidróxido de cálcio. Como propriedades do iodofórmio, o autor afirmou que, segundo Walkhoff, ele não é irritante, é reabsorvível, paralisa secreções, tem ação anti-séptica de longa duração até ser reabsorvido e é bem tolerado pelos tecidos periapicais, produzindo fechamento fisiológico do ápice. O hidróxido de cálcio, por sua vez, seria mais útil para obturação após pulpectomia ou pulpotomia.

Maisto e Eurasquin (1965) analisaram o comportamento dos tecidos periapicais frente a algumas pastas reabsorvíveis à base de iodofórmio. Avaliaram, para isso, o tratamento endodôntico de 60 ratos que foram divididos em grupos obturados com três pastas reabsorvíveis: a) pasta lentamente reabsorvível de Maisto - 14g de óxido de zinco, 42g de iodofórmio, 2g de timol, 3cc de clorofenol canforado, 0,50g de lanolina; b) pasta rapidamente reabsorvível de Maisto - clorofenol canforado e glicerina em partes iguais; c) pasta rapidamente reabsorvível de iodofórmio e hidróxido de cálcio - em proporções iguais em uma solução aquosa. Os autores observaram que as pastas utilizadas ativam a resposta inflamatória, e que, quando da ocorrência de extravasamento, o material é facilmente reabsorvido. Em dentes jovens foi obtido um selamento completo do conduto; já em dentes de ratos mais velhos houve simplesmente uma diminuição de sua luz. A reação às pastas não apresentou diferenças significativas; a reabsorção do cemento apical não parece ter relação direta com a sua utilização.

Maisto (1975) relatou que as pastas anti-sépticas à base de iodofórmio e clorofenol canforado-mentol ou glicerina são rapidamente reabsorvíveis na zona periapical. O iodofórmio é acentuadamente radiopaco, volatiliza-se lentamente em contato com o ar e à temperatura ambiente, porém de forma mais rápida quando a 37ºC. Além disso, agregado a outros anti-sépticos é perfeitamente tolerado no periápice, ainda que em grandes sobreobturações. Seu valor como anti-séptico é relativo, mas são bem conhecidas as reparações de extensas lesões periapicais posteriormente à sua aplicação. O iodofórmio libera iodo em estado nascente ao entrar em contato com o tecido periapical, estimula a formação de novo tecido de granulação, o que contribui para a posterior reparação óssea. Ele atua em melhores condições privado de oxigênio e em meio alcalino. Sua ação depende da quantidade e concentração das drogas assim como da sua velocidade de reabsorção.

Valendo-se de dentes permanentes de seis cachorros sem o ápice completamente formado, Vojinovic e Srnié (1975) avaliaram a resposta histológica dos tecidos periapicais - e subseqüente formação destes tecidos - frente a duas pastas utilizadas como materiais obturadores: a) iodofórmio e Chlumsky (I-C) - 30g de fenol, 30g de cânfora e 110g álcool absoluto; b) hidróxido de cálcio. Foram extirpadas, de cada animal, as polpas de dois pré-molares vizinhos – e cada um deles foi preenchido com uma das pastas. Os cachorros, divididos em dois grupos, foram sacrificados após 2 meses (grupo 1) e após 7 meses e meio (grupo 2) para observação histológica. Radiograficamente os grupos não apresentaram grandes diferenças porém, histologicamente, a pasta I-C, no grupo sacrificado após dois meses, apresentou uma inflamação crônica em continuidade com o periodonto, e a presença de tecidos mineralizados que formavam uma barreira menor que a formada pelo hidróxido de cálcio. Após 7 meses e meio (grupo 2), ambos os tratamentos levaram à formação de um tecido mineralizado na região apical.

Castagnola (1976) verificou o papel da pasta iodoformada de Walkhoff na terapia endodôntica. Duas das preparações originais de Walkhoff mereceram destaque:a) a solução de clorofenol-cânfora-mentol e b) pasta de iodofórmio – pastas Kri. Estas manipulações possuem como propriedades a estimulação da formação de tecido de granulação, diminuição da secreção, radiopacidade, facilidade de manipulação, podendo controlar sua consistência, além do fato de ser facilmente removível e reabsorvível. Suas contra-indicações, referem-se ao fato das mesmas serem reabsorvidas do interior do canal, bem como o seu não endurecimento - o que não permite um selamento adequado -, o gosto desagradável e o fato de poder desenvolver alergias. Sua indicação corresponde aos casos de extirpação da polpa, tratamento de abscessos, podendo ser utilizado como medicação entre as sessões ou na obturação, onde ao cimento é acrescida uma pequena quantidade de. Ainda estão indicadas estas pastas, como preenchimento da fístula artificial em pacientes jovens, tratamento preparatório para apicetomia e tratamento preparatório para implante endodôntico.

Semeraro e Magalhães (1978) referem-se às vantagens de se utilizar o iodofórmio em Endodontia, pois este apresenta condições propícias à liberação do iodo contido na pasta: o canal não tem luminosidade; a temperatura do corpo oferece condições para sua decomposição; há exsudatos derivados de matérias necróticas com as quais o iodofórmio entra em contato, liberando iodo; esse iodo penetrará nos túbulos dentinários, mesmo quando associado em pasta, desde que se utilizem veículos com baixa tensão superficial. Assim, esse anti-séptico pode ser utilizado tanto em polpas vivas quanto em polpas necrosadas, e é indicado em casos de lesões mais severas.

Michel, em 1984, estudou a reação de subcutâneo de camundongos submetidos a ação da pasta obturadora de condutos radiculares de dentes decíduos proposta por Guedes-Pinto. Após o implante no dorso do animal, os mesmos eram sacrificados após 24 horas, três, sete, 14, 28 e 90 dias. Até os três dias verifica-se a presença de edema e infiltrado inflamatório agudo; aos sete dias, o material está envolto em uma cápsula conjuntiva com a presença de macrófagos, infiltrado mononuclear e raros polimorofonucleares; aos 28 dias, o material é encontrado fagocitado por macrófagos e aos 90 dias os tecidos exibem características de normalidade.

Para analisar clinicamente uma alteração da pasta de Walkhoff em tratamento da necrose pulpar, Rocca et al. (1985) analisaram 59 pacientes com diferentes patologias (granulomas, abscessos crônicos e agudos e cistos). Os dentes foram instrumentados e obturados com uma pasta modificada pelo acréscimo de 1,00g de prata na composição. Para a avaliação do sucesso, foram observadas a mobilidade dental - que diminuiu significativamente - e a dor pós-operatória – que apresentou 10% de ocorrências. Radiograficamente, todos os casos mostraram reparação após seis meses de observação, à exceção dos cistos.

Foi realizada uma avaliação da resposta histopatologica pulpar de ratos a uma pasta - composta por Iodofórmio, Rifocort® e Paramonoclorofenol canforado (PMCC) em partes iguais - comparada ao formocresol. Após períodos de 3 e 7 dias, as duas pastas apresentavam condições semelhantes de inflamação aguda com a atração de macrófagos para a região imediatamente inferior da cavidade pulpar em contato com a pasta. Após 14 dias a área de necrose foi mantida ou aumentada para o formocresol enquanto a pasta apresentava a polpa com características de normalidade inclusive com a formação de ponte de dentina. Em 28 dias o formocresol ampliou sua área de degeneração enquanto a pasta estimulou a formação de ponta de dentina sobre um tecido pulpar normal.(CHEDID, em 1988)

Manisali, Yücel e Erisen (1989) descrevem um caso onde houve o extravasamento da obturação com uma pasta iodoformada do canal de um segundo pré-molar inferior esquerdo. O extravasamento não se limitou à região periapical, mas foi até a região do segundo molar.  Pode ser verificado que não houve alteração alguma na região nem sintomatologia dolorosa por parte do paciente, se ndo a pasta rapidamente reabsorvida.

Para verificar se havia uma interação entre o iodofórmio e a endotoxina bacteriana, Fernandes (1997) adotou o teste de coagulação do lisado de amebócitos do artrópodo Limulus polyphemus (teste LAL), a ressonância magnética nuclear de prótons e a análise espectrofotométrica. Com base nos resultados obtidos, o autor concluiu que possivelmente existe uma interação química entre o iodofórmio e a endotoxina bacteriana, e que essa alteração deve ocorrer na sua porção polissacarídica.

Foi realizado um estudo para comparar, in vitro, a citotoxicidade do iodofórmio e do hidróxido de cálcio - associados a dois veículos diferentes: carbowax e PEG 400 - frente a fibroblastos NIH 3T3. O iodofórmio revelou ser citotoxico tanto na reação celular imediata , como também nos experimentos de sobrevivência celular a longo prazo, sendo menos agressiva quando associada ao Carbowax. Já o hidróxido de cálcio mostrou ser não citotoxico independente do veículo e do experimento ora avaliado. (DANIEL, 1998).

Em 1999, Daniel, Jaeger e Machado. realizaram de uma revisão da literatura sobre a utilização do iodofórmio como medicação intracanal. Seu emprego em Endodontia é limitado por possuir odor penetrante e desagradável, além de poder promover alteração cromática da coroa dental e reações adversas em pacientes sensíveis. Sua capacidade anti-séptica parece estar relacionada à maior liberação de iodo em estado nascente quando em contato com secreções ou áreas infectadas. Como características positivas dessa droga os autores arrolam a radiopacidade, o grau de penetração nos tecidos periapicais, a analgesia que promove, a diminuição da secreção de feridas, a facilidade de reabsroção e a propriedade de estimulação biológica. Salientam-se seu poder irritante, a tolerância tecidual e a ação estimulante da formação de tecido de granulação cicatricial e toxicidade. As propriedades irritantes do iodofórmio estimulam a proliferação celular, produzindo reação inflamatória inicial com necrose tecidual, o que atrai células de defesa para a região e leva à formação de um tecido de granulação e neoformação óssea, favorecendo o reparo da lesão.

Pallotta, em 2001, avaliou a ação antibacteriana de quatro medicações de uso endodôntico pelo método da diluição em caldo. As medicações avaliadas foram o Iodofórmio, o Hidróxido de Cálcio e duas associações, o CFC - 25% de Ciprofloxacin, 25% Metronidazol e 50% Hidróxido de cálcio – e o IKI – 2% Iodo, 4% Iodeto de potássio - sobre o Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Bacteroides fragilis. O experimento consistia na incubação em tubos de ensaio de uma associação entre bactérias e meio de cultura na qual deveria ser acrescentada a medicação em dez diferentes concentrações. Após o período de incubação, o crescimento deveria ser avaliado pela turbidez do tubo, comparando com a escala de MacFarland. Com exceção do IKI sobre o Pseudomonas aeruginosa, todos os medicamentos apresentaram ação sobre as bactérias estudadas. Outra observação diz respeito ao aumento da ação de todas as drogas a medida que as mesmas possuíam suas concentrações aumentadas.

O processo de reparo de lesões periapicais foi avaliado por Daniel, em 2001, através de análises radiográfica e microscópica após o emprego de medicação intracanal em molares de ratos nos quais foi induzida lesão periapical. Depois de abertos e instrumentados, os canais foram medicados com iodofórmio (com Carbowax®), hidróxido de cálcio (com polietilenoglicol 400) e CFC (com PRP). Os animais foram sacrificados após 7, 15 e 30 dias e as peças analisadas radiográfica e  microscopicamente. Os resultados mostram a formação de lesões periapicais após os períodos experimentais e que todas as substâncias utilizadas neste estudo contribuíram para a diminuição da lesão periapical. No final de 30 dias, não houve diferença estatisticamente significante entre as medicações testadas, no tocante a freqüência de lesão periapical, intensidade do infiltrado inflamatório e processo de reparo.

Os procedimentos para o tratamento de dentes portadores de lesão endodôntica a base de iodofórmio são descritos por Pallotta, em 2002. O autor descreve o modus faciendi da medicação por meio de sua inserção e pela realização de trocas constantes ate que se tenham sinais clínicos de que a lesão esteja diminuindo radiograficamente e os sinais e sintomas tenham desaparecido.

A atividade antibacteriana do Iodofórmio e do Hidróxido de Cálcio associados à dentina foi comparada por Breder (2003).  Raízes extraídas de molares superiores necrosados e com lesão periapical eram trituradas e misturadas às medicações testadas. Também foram obtidas bactérias de biofilmes dentais. Pelo método da difusão em ágar, foi observado que ambas as drogas possuíam atividade antibacteriana semelhante e que esta propriedade não sofreu ação inibitória da dentina.

Gomes, em 2003, valendo-se de dentes de cães, avaliaram a resposta tecidual após tratamento endodôntico em dentes portadores de lesões induzidas, realizados em sessão única ou com curativos de demora a base de iodofórmio e hidróxido de cálcio, estes que permaneciam por 15 dias. Os tratamentos eram analisados histologicamente após 30 e 90 dias. Pode ser observado comportamento semelhante nos grupos tratados com curativo de demora com inflamação branda e freqüente visualização de neoformação óssea e cementária, ao passo que no grupo dos dentes tratados em sessão única, foi encontrado infiltrado inflamatório severo, sem indícios de processo de reparação.

2.3.1. Hidróxido de Cálcio 

O hidróxido de cálcio é um pó branco, pouco solúvel em água e de pH bastante elevado. É obtido quimicamente pela hidratação do óxido de cálcio – que, por sua vez, deriva da calcinação do carbonato de cálcio. Seu mecanismo de ação depende diretamente da liberação de íons cálcio (Ca++) e hidroxila (OH-), que ocorre mediante o contato entre a droga e os tecidos (SIQUEIRA; LOPES, 1999; FAVA; SAUNDERS, 1999).

Heithersay, em 1975, demonstrou os efeitos da utilização do hidróxido de cálcio no tratamento de dentes despolpados com patologias. Clinicamente ele está indicado como medicação intracanal, tanto temporária como por longos períodos, no controle das reabsorções radiculares, defeitos de reparação internos e externos, perfurações, fraturas transversas, sendo ainda possível a indução da formação apical de dentes despolpados. Seus principais mecanismos de ação, segundo o autor, dizem respeito à sua alcalinidade, em contrapartida às inflamações que são ácidas e às bactérias que raramente resistem a pH superiores a 9,5. Uma outra hipótese de mecanismo de ação desta droga é relativa à presença de cálcio que pode levar à diminuição da permeabilidade de vasos que estão presentes em granulomas, além de poder agir na síntese de colágeno, cuja formação da matriz é dependente de enzimas que também dependem de cálcio.

A ação clínica do hidróxido de cálcio utilizado como medicação intracanal em 78 casos de dentes não vitais foi o objetivo do trabalho realizado por Vernieks e Messer (1978). Para tanto foram selecionados 64 pacientes, dos quais 75 dentes apresentavam lesão periapical. A avaliação do sucesso era clinica e radiográfica. Foi obtida uma diminuição da lesão em 75 casos (em 55 o completo desaparecimento) e outros 3 que não apresentam solução ( 2 apicetomia e 1 exodontia). Um outro fator a ser considerado foi a necessidade de um maior tempo para reparar a lesão em lesões mais extensas e em dentes multirradiculares.

Com o objetivo de desenvolver um método de deflagrar a infecção dentinária - e assim avaliar a ação de medicações intracanais -, Haapasalo e Ørstravik (1987) valeram-se de dentes bovinos. Os dentes eram desgastados e recortados para formar um cilindro padrão, submetidos a um tratamento para remoção do smear–layer e, posteriormente, esterilizados. Esses corpos de prova eram transportados para um caldo nutriente com E.faecalis. Após 3 semanas, os canais eram vedados externamente, e seu interior era preenchido com a medicação escolhida - Calasept ou o PMCC. A extração das amostras bacterianas era realizada com brocas esféricas de tamanhos progressivamente maiores, e também com a coloração de Brown e Brenn para a verificação de sua infiltração. Os autores observaram que o PMCC eliminou o E.faecalis, mesmo em grandes profundidades, enquanto o Calasept não eliminou o microorganismo de forma adequada nem sequer superficialmente.

Foreman e Barnes, em 1990, realizaram uma revisão a respeito do hidróxido de cálcio. Como principais propriedades bioquímicas desta droga, puderam ser notadas: (a) iniciação da mineralização; (b) mineralização induzida por ele; (c) formação de ponte de dentina; (d) capacidade de destruição bacteriana; (e) dissolução de tecido necrótico. Todos esses mecanismos de ação dependem diretamente do pH desta droga. O hidróxido de cálcio, como medicação intracanal, é utilizado sob a forma de pó acrescido ou não de um líquido, este que pode ser inerte, ou com ação específica. O Ca(OH)₂ é de grande valia na apicigênese e na apicificação, auxiliando na prevenção e tratamento da reabsorção radicular, ainda no reparo de perfurações de furca e de fraturas horizontais.

Foi realizado um estudo para avaliar se há alguma alteração no lipopolissacarídio (LPS) da membrana bacteriana após o tratamento com hidróxido de cálcio, medido pela produção de Prostaglandina E2 (PGE2). Foram utilizados dois grupos: um era tratado com o hidróxido de cálcio em cultura de células de monócitos; o outro não recebia tratamento; ambos eram monitorados para detecção da presença da PGE2. Verificou-se a presença dessa linfocina somente nas células do grupo não tratado (SAFAVI; NICHOLS, 1994).

Kontakiotis, Nakou e Georgopoulou (1995) realizaram um estudo, in vitro, para avaliar o mecanismo de ação do hidróxido de cálcio. Para a realização do estudo, os autores selecionaram quarenta microorganismos de isolados clínicos - 20 anaeróbios estritos e 20 facultativos. Após identificados, esses microorganismos eram diluídos (até 10⁶ da amostra inicial) e inoculados em dois meios: 1) ágar-sangue - grupo controle; 2) ágar-sangue misturado a uma pasta de hidróxido de cálcio em um veículo, na proporção de 6:4. As placas eram colocadas em estufa por 72 horas de forma anaeróbia; transcorrido esse período, verificava-se o número de colônias formadas. O grupo tratado apresentou redução do número de cepas, o que indica que a ação do pH no meio é importante para diminuir o desenvolvimento das bactérias.

Barbosa et al., em 1997, compararam a ação bactericida do hidróxido de cálcio, gluconato de Clorexidine e PMCC in vitro. Após a seleção de dentes com polpas necrosadas e presença radiográfica de lesão periapical, os mesmos eram abertos, instrumentados e medicados com PMCC numa primeira sessão. Na segunda sessão, realizava-se uma amostra microbiológica dos condutos sendo os dentes preenchidos com uma das medicações. O canal deveria ser obturado a medida que a cultura do seu interior fosse negativa. Um outro experimento foi realizado pelo teste de difusão em Agar dos medicamentos contra microorganismos anaeróbios e facultativos. Culturas negativas foram obtidas em 69,2% dos casos na segunda sessão; e, na sessão seguinte, 73,3% no caso do hidróxido de cálcio e 77,8% nos casos de Clorexidine. Na difusão em ágar, o Clorexidine apresentou ação contra todas as cepas, sem, contudo ser mais eficaz que o PMCC. O hidróxido de cálcio só apresentou atividade antibacteriana contra o A. naeslundi e o A. israelii.

Os mecanismos de ação antimicrobiana do hidróxido de cálcio e suas limitações têm sido objeto de estudos. Os principais mecanismos de eliminação das bactérias por essa droga são a lise da membrana celular citoplasmática - que, por meio da peroxidação lipídica destrói os fosfolipídios da membrana -; a desnaturação de proteínas - as enzimas bacterianas possuem um pH ótimo de ação, e a presença do Ca(OH)2, que é bastante alcalino, pode bloquear essa ação; a ação direta dos íons hidroxila – que agem como oxidantes de radicais livres - sobre as proteínas estruturais; os danos que o Ca(OH)2  provoca no DNA – seja demembrando-o por ação direta, seja pela ação de radicais livres, que impedem ou alteram sua replicação - obstruindo, desta forma o desenvolvimento normal da célula (SIQUEIRA; LOPES, 1999).

Fava e Saunders, em 1999, realizaram uma revisão das pastas de hidróxido de cálcio no que se refere ao tipo de veículo utilizado, estabelecendo uma classificação e as respectivas indicações clínicas. A utilização de diferentes veículos nos leva a algumas alterações das propriedades, especialmente no que se refere à velocidade e concentração da liberação de íons, como também seu poder antibacteriano. Os aquosos possuem como características uma liberação rápida de íons, sendo indicados no capeamento pulpar, tratamento de dentes sem vitalidade, apicigênese e apicificação, pulpotomias de decíduos e permanentes, como medicação temporária em polpas vitais e ainda nos casos de reabsorção inflamatória interna. Os veículos viscosos e oleosos mostram liberação de íons mais lenta, porém mais duradoura, estas pastas devem ser indicadas em casos de reabsorções interna e externa, bem como no tratamento das periodontites apicais , com forte ação antibacteriana.

Haapasalo et al. (2000) avaliaram a inibição que a dentina provoca na atividade antibacteriana de alguns medicamentos. Foram testados o hidróxido de cálcio em solução saturada, o hipoclorito de sódio a 1% e a 0,5%, a clorexidina a 0,05% e o IKI na proporção de 2/4%. A dentina utilizada foi autoclavada e reduzida a pó; uma parte dela era incubada com os medicamentos em tubos testes a 37°C por 24 horas ou 1 hora antes da adição da bactéria Enterococcus faecalis. Os resultados apontaram que o pó de dentina tem ação inibitória sobre todos os medicamentos. Ele inibiu por completo a ação do hidróxido de cálcio, e parcialmente a do IKI, inibindo muito pouco a ação dos demais.

Através do método proposto por Haapasalo e Ørstavik, em 1987, foi avaliada, in vitro, a ação do hidróxido de cálcio com a adição de cobre ou IKI para desinfetar túbulos dentinários. Trinta e seis cilindros de dentina bovina eram infectados com E.Faecalis e divididos em quatro grupos, um somente com hidróxido de cálcio veiculado em água destilada, outro em que era acrescido o pó do IKI, um terceiro grupo que era preparado com cobre e um quarto controle sem medição.Os melhores resultados foram obtidos com a adição de cobre, não importando a profundidade da avaliação realizada, seguido do grupo em que foi adicionado o IKI e por fim o grupo só com a água destilada, este que praticamente não apresentou ação em profundidade superior a 300μm. (Fuss et al, 2002)

Com o objetivo de avaliar a hipótese do E.faecalis resistir a ação da medicação intracanal a base de hidróxido de cálcio, Distel, Hatton e Gillespie (2002) avaliaram, por meio de microscopia eletrônica de varredura e por meio do microscópio laser de varredura confocal a formação do biofilme periapical. Puderam observar, tanto no grupo medicado como no controle a formação deste biofilme valendo-se de dentes extraídos.

Gomes et al, em 2002, propuseram-se a investigar possíveis variações na suscetibilidade de diferentes microorganismos a associações do hidróxido de cálcio a diferentes veículos. A metodologia utilizada foi a difusão em ágar. Pôde ser observada uma maior ação, na média dos diferentes veículos, sobre P.endodontalis, P.gingivalis, C.albicans, P.intermédia/ nigrescens, P.denticola, S.aureus, S.sanguis, B.subtilis, S.mutans, S.sobrinus, A.naeslundii e E.faecalis, respectivamente. Enquanto as associações que apresentaram maior ação em avaliação decrescente foram ao PMCC com glicerina, PMCC, glicerina, solução salina, água destilada estéril e polietilenoglicol.

Em 2002, Nelson Filho et al, propuseram-se a avaliar, por meio de radiografias, o efeito da endotoxina associado ou não ao hidróxido de cálcio em dentes de cães. Dos 60 pré-molares testados, pode ser verificada a presença de lesão nos grupos em que a endotoxina era introduzida no canal sem associação da medicação e também no grupo em que a lesão era induzida por inoculação bacteriana. Tanto no grupo controle – solução salina – como no grupo da associação medicação-endotoxina a lâmina dura apresentava-se íntegra, sendo assim, o LPS foi inativado pela medicação.

A cura de lesões apicais de dentes com culturas positivas e negativas de canal no momento da obturação, bem como de dentes tratados em uma visita e duas com a utilização de medicação de hidróxido de cálcio entre elas foi o objetivo do trabalho realizado por Peters e Wesselink (2002). Dos 39 pacientes avaliados, dos quais 18 foram medicados, não puderam ser observadas diferenças entre os grupos estudados durante o acompanhamento por quatro anos e meio. O único caso que não obteve sucesso foi do grupo medicado.

De Moor e De Witte, 2002 relataram 11 casos de lesões periapicais em que uma grande quantidade de hidróxido de cálcio foi extravasada para o periápice e que, a despeito da não recomendação por parte da literatura pertinente, promoveram sucesso. Todavia, como efeito colateral houve um alto índice de inchaço pós-operatório que variou de moderado a intenso.

Em 2003, Haenni et al., propuseram-se a avaliar se havia alterações do pH da parede dentinária quando da associação de uma solução de hidróxido de cálcio ao IKI, clorexidine e soluções de hipoclorito, bem como a ação antiomicrobiana destas associações sobre o E.faecalis pelo método da difusão em agar. Nenhuma alteração significativa do pH pode ser verificada, nem alteração em sua eficácia antimicrobiana.

2.4. Metodologia Empregada para avaliação da Ação Biológica

Hauman e Love, em 2003, realizaram uma revisão da literatura no que se refere às metodologias empregadas para a avaliação da biocompatibilidade de materiais utilizados na terapia endodôntica que podem, uma vez extravasados para a porção periapical, estabelecer uma comunicação com o tecido vivo. Entre as metodologias empregadas estão os testes de genotoxicidade, em que se incluem as culturas de células, as reações teciduais a microorganismos e o implante em dorso de animais, em especial de ratos, além de sua aplicação em condições clínicas, primeiro em animais e posteriormente em humanos. Nesse mesmo estudo, o hidróxido de cálcio mostrou ser uma droga bastante inerte quando permanece dentro do canal, todavia, sua tolerância na região periapical demonstra resultados contraditórios, sendo bastante agressivo quando extravasado.

2.4.1. Dorso de ratos 

O tecido cutâneo do rato é composto por uma epiderme fina e coberta de pelos. A derme é caracterizada por um grande conteúdo celular, em especial em ratos jovens, com fibras colágenas em disposição paralela às células epiteliais, cortadas por fibras elásticas. Sua camada basal apresenta vasos sanguíneos e elementos elásticos próximos a folículos pilosos e glândulas sebáceas. A hipoderme apresenta conteúdo moderado de tecido adiposo. (HEBEL; STROMBERG, 1976)

O comportamento do tecido conjuntivo o subcutâneo de rato quando submetidos a implante dos cimentos AH 26 e N-Rickert foi avaliado utilizando 18 animais (Rattus norvegicus), os quais foram sacrificados segundo o período de experimentação, de 0, 1, 3, 5, 7, 10, 16, 23 e 34 dias. O implante era injetado no subcutâneo dos animais, sendo duas amostras de cada cimento em cada animal. Segundo o período estipulado, o material deveria ser colhido e processado histologicamente, corado com H-E, tricrômico de Mallory e Alcian Blue + PAS. Pôde ser observado que o cimento AH-26 promove interna reação inflamatória duradoura além de ser reabsorvível o que não acontece com o N-Rickert, sendo este mais compatível. (GUARACIABA; FAVA DE MORAES, 1980).

Tubos de Teflon contendo diferentes materiais de uso endodôntico – Kloroperka, NØ, AH26 e Kerr Pulp Canal Sealer – foram implantados em dorso de ratos para testar a biocompatibilidade dos mesmos em estudo desenvolvido por Olsson, Sliwkowski e Langeland, em 1981. Por meio de análise morfométrica pode ser observado que todos os materiais foram irritantes. A severidade variou conforme o grupo, podendo se afirmar que o método é eficaz para testar a biocompatibilidade apesar de não ser possível classificar a citotoxicidade em diferentes níveis a não ser que as mesmas sejam muito diferentes.

A reação tecidual do subcutâneo de ratos também foi objeto de estudo realizado por Safavi, Pascon e Langeland, em 1983. A avaliação mostrou necrose e inflamação continuada em todos os períodos experimentais quando injetados no subcutâneo para o AH26 e para o Hydron, quando avaliados qualitativa e quantitativamente nos diferentes períodos de avaliação.

Com o objetivo de (a) avaliar a resposta tecidual a cimentos endodônticos, bem como (b) padronizar uma metodologia, além de (c) correlacionar as respostas teciduais aos elementos liberados do material identificados por microanálise radiográfica, Ørstravik e Mjör, em 1988 implantaram tubos de polietileno preenchidos com um dos cimentos, no dorso do rato. Pode ser observado que esta metodologia é eficaz na qualificação da tolerância tecidual inclusive com diminuição em função do tempo de sua agressividade

Em 1988, Yesiloy et al, avaliaram a resposta histopatológica, inflamatória e de calcificação a cimentos obturadores endodônticos e um material a base de hidróxido de cálcio (Hypocal). Utilizaram 12 cobaias, em cujo dorso era colocado 0,1mL de cada um dos materiais a serem avaliados. Os animais foram sacrificados após seis, 15 e 80 dias, nos quais eram removidos os sítios, processados histologicamente e corados com H-E e Von Kossa. Frente aos campos histológicos, era dado um score para os quadros inflamatórios representados de 0 a 5 em valor crescente. Após seis dias, o Sealapex e o Endo-Fill apresentavam um menor quadro de inflamação, que se manteve nos 15 dias, onde o Eucapercha também teve resultado semelhante, significativamente superiores aos demais. Por fim, no período de 80 dias todos apresentarem um grau baixo e semelhante de inflamação.

Em 1988, Zmener, Guglielmotti e Cabrini propuseram-se a avaliar o comportamento de dois cimentos a base de hidróxido de cálcio, através do implante de três tubos de silicone - um com cada cimento e um outro grupo controle - em 30 ratos Wistar. Passados os períodos experimentais, os tubos eram removidos em bloco, processados e avaliados histologicamente por meio da contagem de células inflamatórias. Após sete dias ambos os grupos apresentavam uma grande presença de macrófagos diferente do grupo controle. No CRCS pode ser ainda verificada a presença de LPMN, linfócitos e células gigantes junto aos tubos, além de uma proliferação de fibroblastos. Passados 30 dias o Sealapex manteve a resposta inflamatória aguda, enquanto a mesma diminuiu significativamente no CRCS, quadro este que se manteve após 90 dias.

2.4.2. Cultura de Células 

A citotoxicidade de doze materiais de uso endodôntico em cultura de fibroblastos do ligamento periodontal – diretamente ou com a interposição de um cilindro de dentina – foi realizada por Meryon e Brook, em 1990. Pôde ser observada uma maior citotoxicidade para a Pasta Kri, Spad e Forfenan, seguidos do AH26 (com e sem prata) e Endomethasone para qualquer das duas avaliações. Os demais também apresentaram citotoxicidade significativa que diminuiu com a colocação do cilindro de dentina.

Avaliar a citotoxicidade de diferentes cimentos de uso endodôntico submetidos ao calor, por meio do teste da quantificação de adesão e proliferação de fibroblastos gengivais foi o objetivo do trabalho realizado por Neff, Laymane Jeansonne, 2002. Valendo-se de sete cimentos diferentes, a saber: Roth 801, Roth 811, AH26, AH Plus, Kerr Pulp Canal Sealer, Sealapex e Dentalis, que eram submetidos a três temperaturas diferentes 23º C, 43º C e 100º C. Como resultados, os autores obtiveram que a temperatura altera a citotoxicidade dos cimentos, sendo, dos cimentos testados, o AHPlus, AH26 – resinosos – e o Sealapex – a base de hidróxido de cálcio – os menos agressivos.

Schwarze, Leyhausen e Gerutsen (2002), propuseram-se a avaliar, in vitro, a citotoxicidade de diferentes cimentos por um longo período de tempo. Valendo-se de raízes dentais que eram obturadas com um cone único e quantidades semelhantes de cimentos diferentes - AHPlus, Apexit, Endomethasone, Ketac-Endo, N2 e Roeko Seal – as quais eram mantidas em meio próprio, verificava-se, periodicamente,  a sua ação sobre células de ligamento periodontal embrionárias e fibroblastos 3T3. Para ambas as células, o N2 foi o mais citotoxico, enquanto os demais não apresentaram efeito agressivo.

 

3 PROPOSIÇÃO 

O presente estudo tem por objetivo avaliar quantitativa e qualitativamente as reações que o organismo desenvolve em relação a duas drogas utilizadas como medicação intracanal – iodofórmio e hidróxido de cálcio – a luz da microscopia óptica.

 

4 MATERIAL E MÉTODOS

 4.1.           Material

Para a realização deste estudo, foram selecionados vinte ratos albinos (Rattus norvegicus, var albino, linhagem Wistar), machos convencionais, pesando 300±120g, obtidos no Centro de Bioterismo da PUCCAMP. Durante o experimento, os ratos foram mantidos em caixas de acrílico com tampa de aço inoxidável, lavadas semanalmente e desinfetadas com álcool etílico a 90°. Os animais receberam água filtrada e ração para animais de laboratório esterilizada em autoclave ad libitum. A cama em maravalha também foi esterilizada e ciclos de luminosidade 12:12.

4.1.1.     Anestesia

-        Cloridrato de Cetamina (FRANCOTAR ^®) – Vibrac do Brasil indústria e Comércio Ltda.;

-        Cloridrato de Xilazina (ROMPUN^®) – Bayer do Brasil S/A;

-        Seringas de insulina com divisão em décimos com 1mL – BD – Indústria Brasileira Ltda. SP.

4.1.2.     Incisão, divulsão e sutura dos tecidos manipulados do Animal

-        Agulha atraumática (Erwin Guth Ltda. – São Paulo – SP – Brasil);

-        Bisturi (Erwin Guth Ltda. – São Paulo – SP – Brasil);

-        Fio de algodão #50 preto;

-        Lâminas de bisturi #15 (Embramac do Brasil Ltda..– Itapira – SP – Brasil);

-        Maquina para depilar;

-        Porta agulha (Erwin Guth Ltda. – São Paulo – SP – Brasil);

-        Tesouras rombas, reta e curva (Erwin Guth Ltda. – São Paulo – SP – Brasil);

4.1.3.     Medicação utilizada

-        Iodofórmio (Fórmula & Ação Farmácia Magistral Ltda. – São Paulo - SP);

-        Carbowax (Fórmula & Ação Farmácia Magistral Ltda. – São Paulo - SP);

-        Hidróxido de Cálcio (Fórmula & Ação Farmácia Magistral Ltda. – São Paulo - SP);

-        Polietilenoglicol (Fórmula & Ação Farmácia Magistral Ltda. – São Paulo - SP);

4.1.4.     Processamento Histológico

-        Álcool absoluto – etanol (Laboratório de patologia da PUCCAMP);

-        Caixas de 100 lâminas (Laboratório de patologia da PUCCAMP);

-        Corante Hematoxilina e Eosina (Laboratório de patologia da PUCCAMP);

-        Corante tricrômico de Mason - Hematoxilina, Fucsina Ácida e Azul de Anilina e ácido fosfomolibdico (Laboratório de patologia da PUCCAMP);

-        Lâmina de borda fosca (LAMEDID Comercial e Serviços LTDA – Barueri - SP)

-        Lamínula 24 X 32 (LAMEDID Comercial e Serviços LTDA – Barueri - SP.)

-        Parafina – HISTOCEC;

4.2.           Metodologia Experimental

4.2.1.     Grupos Experimentais 

A avaliação realizada por meio do implante dos materiais em dorso de ratos é a mesma utilizada por Guaraciaba e Fava de Moraes, em 1980.

Os animais foram distribuídos em quatro grupos experimentais, sendo que para cada animal testado, foram utilizados dois sítios diferentes para a colocação da medicação, totalizando dezesseis espécies estudadas, mais duas espécies para cada um dos grupos controle.

I. Procedimento anestésico

Todos os animais foram anestesiados com a seguinte mistura:

a) Cloridrato de Xilazina (ROMPUN^®): na dosagem de 10mg/kg de peso;

b) Cloridrato de Cetamina (KETAMINA ^®): na dosagem de 80mg/kg de peso;

Em condições práticas isso representou 1,6mL de KETOMIN ^® adicionado a 0,5mL de ROMPUN^® . Do total da mistura (2,1mL), utilizar 0,21mL/100g peso. Essa mistura foi aplicada com seringa de insulina, por via intraperitoneal.

II. Procedimento Experimental

Após os procedimentos anestésicos e posterior tricotomia da região dorsal, os grupos foram divididos em:

·      Grupo Controle (ou GCI), que será identificado por não ter marca alguma na orelha. Este grupo terá a pele íntegra, sem tratamento algum.

·      Grupo operado (ou GCII), onde os animais deste grupo sofrerão 02 incisões, uma de cada lado na região dorsal, para exposição do tecido celular subcutâneo. Com o auxílio de uma pinça de ponta fina, o tecido subcutâneo será divulsionado até próximo a musculatura, sendo, em seguida a pele suturada com agulha e fio de algodão preto.

·      Grupo operado com tratamento 1, identificado pelo furo na orelha esquerda (FOE). Este grupo passará pelo mesmo tratamento do grupo anterior, diferenciando-se pelo fato do mesmo ser colocado o hidróxido de cálcio associado ao polietilenoglicol 1400 recém-preparado, na concentração clínica, no caminho aberto pela divulsão tecidual.

·      Grupo operado com tratamento 2, identificado pelo furo na orelha direita e esquerda (FOD). O procedimento será o mesmo realizado no grupo FOE exceto que, a medicação usada nestes animais será o iodofórmio associado ao Carbowax®, também recém-preparado e na concentração clínica.

4.2.2.     Coleta de Material 

Passados três dias de pós-operatório, cinco animais dos grupos tratados e dois animais do grupo controle foram, novamente, anestesiados e deles removidas as feridas do lado direito. A pele foi novamente suturada e os fragmentos fixados em líquido de BOUIN (85mL de solução saturada de ácido pícrico, 15mL de formol e, 5mL de ácido Acético glacial, colocado no momento do uso). A fixação foi de, pelo menos 24 horas.

Novos fragmentos foram removidos após cinco e onze dias, num total de 15 por grupo experimental. Mais uma vez os fragmentos eram submetidos aos procedimentos para processamento histológico.

4.2.3.     Inclusão e Microtomia em parafina – colorações 

O material coletado e fixado em BOUIN foi destinado à inclusão e microtomia em parafina. Os cortes, com 3µm eram corados com Hematoxilina-Eosina (H-E) e Tricrômico de Mason (TM). Para cada um dos grupos foram utilizadas cinco lâminas e, de cada uma delas, três campos serão submetidos a avaliação.

4.3.           Metodologia de Avaliação

Em um primeiro momento o aspecto macroscópico da ferida foi avaliado, no que se refere à presença de necrose, exsudato, sendo os aspectos relevantes anotados. Posteriormente, os cortes foram avaliados micrsocopicamente de duas formas:

!. Análise Qualitativa: com auxílio de microscópio óptico, as lâminas com o material foram avaliadas quanto à presença de: crosta fibrino leucocitária, exsudato neutrofílico, edema intersticial, congestão vascular, infiltrado mononuclear (presença de macrófagos), proliferação fibroblástica, neoformação vascular e fibrose intersticial.

II. Análise Quantitativa: com o auxílio do microscópio óptico acoplado à câmara digital, fotos foram tiradas dos diversos campos e inseridas no computador, onde foram dividas com uma grade que contava com 100 pontos diferentes. As fotomicrografias foram tiradas no microscópio com a ocular de 10X e a objetiva de 40X. Foram contadas as estruturas presentes nos campos mais significativos e representativos dos diferentes grupos experimentais.

Nesta avaliação foram contadas, para cada um dos campos as estruturas mais representativas seguindo as seguintes divisões:

a.      células epiteliais;

b.      fibras colágenas;

c.      fibroblastos;

d.      macrófagos;

e.      neutrófilos;

f.        linfócitos;

g.      vasos; e

h.      outros (fibrócitos, espaço, etc...).

4.3.1.     Análise Estatística

Os dados foram colocados em tabelas, seus valores individuais e suas médias foram analisados e comparados estatisticamente, adotando-se como grau de significância o nível de 5%. As comparações foram realizadas entre as diferentes estruturas para um mesmo período experimental. Assim, cada uma dessas comparações foi submetida a análise da distribuição dos dados e aderência a curva normal, verificando sua distribuição, sendo aplicado, em função desta distribuição, o teste estatístico de Kruskal-Wallis .

 

5 RESULTADOS

Para facilitar a compreensão, a apresentação dos resultados será realizada a partir dos diferentes métodos de avaliação, assim teremos: a avaliação macroscópica e microscópica, sendo esta última qualitativa e quantitativa. 

5.1. Análise Macroscópica

Nesta análise, aos três dias, no grupo GCII pode ser visualizado um tecido aparentemente íntegro. O grupo FOD também apresenta um tecido semelhante (Fig 5.1-A). Já o FOE (Fig 5.1–B) mostra uma necrose superficial. Na avaliação seguinte, os grupos FOD (Fig 5.2-A) e GCII apresentam aspecto de normalidade e no FOE (Fig 5.2 – B) não é mais vista área de necrose, sendo agora visualizada uma grande área de edema. Aos 11 dias, o grupo FOD (Fig 5.3–A) mostrava a presença de iodofórmio em um tecido subcutâneo de aparência normal, o que não acontecia com o grupo FOE (Fig 5.3-B) que apresentou um edema grande em alguns animais e em outros uma área de necrose.

 

 

 

 

Fig 5.1. – Fotografia do dorso do rato após 3 dias de P.O. - observação macroscópica dos grupos FOE (A) e FOD (B) mostrando aparente normalidade do tecido no FOD e área de necrose no grupo FOE

 

 

 

 

 

Fig 5.2. – Fotografia do dorso do rato após 5 dias de P.O. - observação macroscópica dos grupos FOE (A) e FOD (B), mostrando no grupo FOE a área de edema, e no grupo FOD a presença de iodofórmio circundada por um tecido aparentemente íntegro.

 

 

 

 

 

Fig 5.3. – Fotografia do dorso do rato após 11 dias de P.O. - observação macroscópica dos grupos FOE (A) e FOD (B) mostrando no grupo FOE a quantidade abundante de exsudato, e no grupo FOD, ainda a presença de iodofórmio circundada por um tecido aparentemente íntegro.

 

5.2. Análise Microscópica

5.2.1. Qualitativa

·      Grupo Controle – 3 dias (Fig 5.4.–A)

Pode ser observada uma reepitelização da área incisada, embora nas áreas centrais podem ser observadas células achatadas em alguns cortes e em outros o epitélio apresenta um maior número de camadas celulares e menor quantidade de queratina. Ainda, algumas espécies exibiam a crosta de fibrina, o que não era constante. Na derme, observa-se, ao longo do corte, um infiltrado celular com predominância de macrófagos, embora nota-se também alguns fibroblastos e neutrófilos. No que diz respeito às fibras colágenas, na borda da incisão há uma pequena quantidade de colágeno tipo III e, imediatamente abaixo, colágeno tipo I. As células adiposas e os músculos apresentam aspecto de normalidade.

·      Grupo Tratado com Hidróxido de Cálcio – 3 dias (Fig 5.4.–C)

Neste grupo pode ser observado o rompimento do epitélio sem sinal da reconstituição do mesmo. A derme apresenta uma grande área de necrose, que se estende aparentemente até a região muscular. Uma crosta de fibrina está presente com uma quantidade grande de células mortas. As células adiposas apresentam-se mais como espaços vazios. Junto à ferida, podem ser vistos alguns macrófagos e pouquíssimos no seu interior. As fibras colágenas que podem ser observadas são as do tipo I na base da ferida e alguns cordões no interior da mesma. Algumas fibras musculares estão em degeneração, com os mioblastos com seu núcleo deslocado.

·      Grupo Tratado com Iodofórmio – 3 dias (Fig 5.4.–B)

Aos três dias de observação, este grupo apresenta o epitélio hiperplasiado e hipertrofiado, com um aumento do número de camadas nas bordas, separadas por fibrina. Na derme, uma área de necrose diminuta restrita à região da ferida, circundada por um pequeno infiltrado inflamatório com predominância de macrófagos e alguns outros fagócitos como células gigantes. Há uma perda parcial da camada de tecido adiposo na região, sem alteração, contudo, da camada muscular. As fibras colágenas que podem ser observadas são do tipo I ao redor de toda a ferida.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig 5.4. Fotomicrografia – tecido celular subcutâneo do rato aos 3 dias de P.O. – A controle – GCII; B – iodofórmio – FOD; C – hidróxido de cálcio – FOE. O corte A apresenta uma grande quantidade de células inflamatórias, fibras colágenas no FOD e a área de necrose no FOE

Fixação: Bouin                       Coloração H.E.                      Aumento : 550X

 

·      Grupo Controle – 5 dias (Fig 5.5.–A)

A área de incisão está completamente reepitelizada, com número de camadas celulares similar às demais regiões, parecem estar totalmente renovado.Na derme, uma grande quantidade de plasma coagulado envolta por um infiltrado inflamatório com predominância de macrófagos e células gigantes esparsas logo abaixo do epitélio seguida por uma grande concentração de fibroblastos. No interior desta área, parece haver alguns neutrófilos. No que se refere às fibras, há uma pequena região de fibrina logo abaixo do epitélio, com colágeno tipo III ao redor e nas demais regiões colágeno tipo I abundante inclusive na base da ferida.

·      Grupo Tratado com Hidróxido de Cálcio – 5 dias (Fig 5.5.–C)

Neste grupo o epitélio continua sem sinais de reparo, há uma grande área de necrose tanto na região epitelial quanto na derme. Na derme, pouco tecido vivo pode ser visualizado, somente uma grande quantidade de células gigantes e uma rede de fibrina na borda da lesão. Logo abaixo, no interior da camada muscular, podem ser observadas células de defesa em especial macrófagos, sendo que não há camada de gordura discernível na região da ferida. O colágeno presente é do tipo I e somente pode ser visualizado na base da ferida.

·      Grupo Tratado com Iodofórmio – 5 dias (Fig 5.5.–B)

As bordas do epitélio, além de apresentarem células com aspecto mais achatado, dando a aparência de estarem deslizando, as mesmas parecem estar se multiplicando, com figuras de mitose, ainda que separadas por uma crosta de fibrina aparentemente menor que a encontrada em 3 dias.. Logo abaixo, na derme onde foi colocada a droga, verifica-se um grande infiltrado inflamatório com muitos macrófagos, além da neovascularização, associados a uma destruição da camada adiposa ainda restrita ao local onde foi inserida a medicação. Fibras colágenas do tipo III podem ser visualizadas na base da lesão onde o infiltrado é menor, além de pequenas quantidades no interior do infiltrado.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig 5.5. Fotomicrografia – tecido celular subcutâneo do rato aos 5 dias de P.O. – A controle – GCII; B – iodofórmio – FOD; C – hidróxido de cálcio – FOE. O corte A apresenta uma grande quantidade de células inflamatórias, o grupo FOD com a neovascularização e presença de células inflamatórias e no FOD e a área de necrose no FOE, bem como o início da resposta inflamatória

Fixação: Bouin                       Coloração H.E.                      Aumento : 550X

 

·      Grupo Controle – 11 dias (Fig 5.6.–A)

O tecido epitelial está íntegro, inclusive com a formação de queratina. Na derme, logo abaixo do epitélio na região da ferida, pode ser observado um pequeno infiltrado com fibroblastos em grande quantidade e alguns macrófagos e células gigantes. Nesta região pode ser observada a presença de colágeno tipo III e no restante uma quantidade abundante de colágeno tipo I.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig 5.6. Fotomicrografia – tecido celular subcutâneo do rato aos 11 dias de P.O. – A controle – GCII; B – iodofórmio – FOD; C – hidróxido de cálcio – FOE. O corte A apresenta uma grande quantidade de fibras colágenas e fibroblastos, o grupo FOD com grande número de células inflamatórias e fibroblastos e no FOD, enquanto o FOE começa a se reorganizar, apesar da presença o hidróxido de cálcio.

Fixação: Bouin                       Coloração H.E.                      Aumento : 550X

 

·      Grupo Tratado com Hidróxido de Cálcio – 11 dias (Fig 5.6.–C)

A observação histológica nos mostra o epitélio começando a se reorganizar com um maior número de camadas celulares nas bordas da ferida, ainda separados por crostas de fibrina. Junto a estas bordas, na derme, observa-se um grande infiltrado inflamatório com predominância de macrófagos, fibroblastos, além de uma grande quantidade de células gigantes. As células adiposas e de fibras musculares começam a se reorganizar apesar de ainda existir uma grande área onde as células adiposas se parecem com vacúolos. Fibras colágenas do tipo III podem ser observadas ao redor da lesão, bem como uma neovascularização abundante.

·      Grupo Tratado com Iodofórmio – 11 dias (Fig 5.6.–B)

As observações histológicas neste grupo mostram um epitélio íntegro. Na derme, logo abaixo da ferida, um conjuntivo íntegro – com colágeno tipo I em abundância -, depois a ferida, circundada por colágeno tipo III, com grande quantidade de macrófagos e células gigantes circundando uma área de necrose. O tecido adiposo com características de normalidade, numa posição logo abaixo das fibras colágenas, e sobre a ferida. Em alguns cortes pode ser observada uma alteração cromática nos folículos pilosos.

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

Fig 5.7. Fotomicrografia – tecido celular subcutâneo do rato – A controle – GCII; B – iodofórmio – FOD; C – hidróxido de cálcio – FOE. Os cortes apresentam colágeno tipo I em diferentes quantidades, nos cortes B e C, logo abaixo do tipo I, a formação do colágeno tipo III.

Fixação: Bouin              Coloração Tricrômico de Mason.   Aumento : 550X

 

5.2.2. Quantitativa

Neste item estarão descritos os resultados obtidos através da contagem da presença nos campos das estruturas avaliadas, as quais serão apresentadas em duas tabelas para todos os períodos.

Na tabela 5.1. as médias dos valores encontrados serão colocados, enquanto na tabela 5.2. serão colocados, no sentido de facilitar a compreensão, as comparações estatísticas realizadas, as quais estão descritas de forma mais detalhada nos ANEXOS.

Como a distribuição dos dados, quando comparados entre si nos diferentes grupos foi não-normal, o teste utilizado foi o de Kruskal-Wallis, levando-se em conta a significância de 5% para se estabelecer uma diferença estatisticamente significante. 

5.2.2.1. Três dias de observação

Passados três dias da intervenção, a análise quantitativa dos dados - apresentada nas Tabelas 5.1 e 5.2. e no Gráfico 5.1. - mostra que os grupos tratados apresentam uma diferença significativa tanto em relação ao grupo controle como em relação ao tecido normal como entre si, com exceção da presença de células epiteliais, as quais, para este estudo, não merecem grande destaque.

O grupo FOD apresenta uma grande presença de fibras colágenas e vasos. No que diz respeito às fibras colágenas, os valores encontrados somente são semelhantes ao tecido normal e estes são significativamente maiores que os demais, enquanto a presença de vasos é significativamente maior para o iodofórmio em relação aos demais grupos observados.

A sua vez, o grupo FOE apresenta uma quantidade significativamente maior de fibroblastos e neutrófilos em relação aos demais grupos, o que também ocorre em relação a presença de outras estruturas, sendo, neste caso, semelhantes ao grupo da ferida controle.

A presença de linfócitos para os grupos tratados é inferior ao grupo da ferida controle, e eles são diferentes entre si. Já no que diz respeito a macrófagos, eles são significativamente menos no grupo do iodofórmio e semelhantes para os demais.

GRÁFICO  5.1.  - estruturas presentes aos três dias de observação histológica para os grupos controle e submetidos aos dois tratamentos – adição de iodofórmio e hidróxido de cálcio

 

5.2.2.2. Cinco dias de observação.

Passados cinco dias da inserção da medicação, a análise histológica quantitativa (Tabelas 5.1. e 5.2. e Gráfico 5.2.) mostra que os grupos tratados apresentam grandes diferenças entre si. A presença de células epiteliais, mais uma vez não apresenta diferenças significativas entre os grupos avaliados.

O grupo tratado com o iodofórmio apresenta uma maior quantidade de macrófagos, neutrófilos, linfócitos e vasos.Estes últimos três em uma quantidade significativamente maior em relação aos demais, enquanto os macrófagos somente maiores significativamente em relação ao outro grupo tratado.

Já o grupo tratado com o hidróxido de cálcio demonstrou uma maior presença de outras estruturas e de fibroblastos, sendo a primeira estrutura em quantidade significativamente maior que os demais e o outro semelhante ao tecido normal apesar de diferente dos demais.

Pode ainda ser salientado que os grupos tratados apresentam uma quantidade significativamente menor de fibras colágenas em relação aos grupos do tecido normal e da ferida controle. 

GRÁFICO 5.2. - estruturas presentes aos cinco dias de observação histológica para os grupos controle e submetidos aos dois tratamentos – adição de iodofórmio e hidróxido de cálcio

5.2.2.3. Onze dias de observação.

Por fim, analisando a Tabelas 5.1. e 5.2. e o Gráfico 5.3., que mostra os dados quantitativos observados após onze dias de inserção da medicação, podemos notar que os grupos caminham para um processo de reparo. Mantém-se a presença bastante semelhante de células epiteliais para os grupos tratados e controle.

Os grupos tratados ora estudados mostram quantidades semelhantes também de macrófagos, fibroblastos e neutrófilos, nestes dois últimos, significativamente maiores que os grupos controle, tanto da ferida como do tecido normal, enquanto no que diz respeito aos macrófagos, eles apresentam-se similares à ferida controle e significativamente maiores que os do tecido normal. 

GRÁFICO 5.3. - estruturas presentes aos onze dias de observação histológica para os grupos controle e submetidos aos dois tratamentos – adição de iodofórmio e hidróxido de cálcio

 

No iodofórmio, ainda temos uma maior quantidade de vasos em relação aos demais grupos, e de linfócitos que no hidróxido de cálcio, ainda inferiores aos da ferida controle. O hidróxido de cálcio, a sua vez, é predominante na presença de outras estruturas em relação a todos os grupos. Os grupos tratados, ainda, possuem significativamente menos fibras colágenas que os grupos controle.

5.2.2.4 – Análise da presença das estruturas ao longo dos períodos experimentais

A avaliação da presença destas estruturas tem como base os dados apresentados na tabela 5.1., assim o gráfico 5.4. representa a distribuição das fibras colágenas, o 5.5. a presença de fibroblastos, o 5.6., 5.7., 5.8., 5.9 e 5.10., de neutrófilos, linfócitos,, vasos e outras estruturas, respectivamente. As células epiteliais não foram ora avaliadas por não ser de interesse para o presnte estudo.

GRÁFICO 5.4. Distribuição da presença de fibras colágenas em função dos períodos experimentais

 

GRÁFICO 5.5. Distribuição da presença de fibroblastos em função dos períodos experimentais

 

GRÁFICO 5.6. Distribuição da presença de macrófagos em função dos períodos experimentais

 

GRÁFICO 5.7. Distribuição da presença de neutrófilos em função dos períodos experimentais

 

GRÁFICO 5.8. Distribuição da presença de linfócitos em função dos períodos experimentais

 

GRÁFICO 5.9. Distribuição da presença de vasos em função dos períodos experimentais

 

GRÁFICO 5.10. Distribuição da presença de outras estruturas em função dos períodos experimentais